Introducción
La aflatoxina M1 (AFM1) es un metabolito hidroxilado de la aflatoxina B1 (AFB1), una micotoxina producida principalmente por los hongos Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus. Estos hongos contaminan con frecuencia materias primas destinadas a la alimentación animal, como el maíz, el trigo, el sorgo, el maní y otros cereales y oleaginosas, especialmente bajo condiciones de estrés hídrico, altas temperaturas y mal almacenamiento (Movassaghghazani & Shabansalmani, 2024; IARC, 2002).
Cuando el animal ingiere pienso contaminado con AFB1, esta se absorbe en el tracto gastrointestinal y se transporta al hígado, donde sufre hidroxilación metabólica mediada principalmente por las enzimas del citocromo P450 (CYP1A2 y CYP3A4), originando la AFM1. Este metabolito es excretado en la leche de los animales de producción, especialmente vacas lecheras, y permanece estable durante el procesado y almacenamiento de los productos lácteos, incluida la pasteurización y la esterilización (Battacone et al., 2009; Anfossi et al., 2013; Universidad de Jaén, 2017).
Se estima que entre el 1 % y el 6 % de la AFB1 ingerida se convierte en AFM1 y se excreta en la leche, siendo la tasa de transferencia carry-over variable según la dosis de AFB1, la especie animal, la producción láctea individual y el estado fisiológico del animal (Gimeno, 2004; Battacone et al., 2009).
La AFM1 es clasificada por la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer (IARC) en el Grupo 2B (posible carcinógeno humano), mientras que la AFB1 se clasifica en el Grupo 1 (carcinógeno humano confirmado). Aunque la AFM1 es menos carcinogénica que la AFB1, presenta un elevado nivel de actividad genotóxica, pudiendo dañar el material genético (ADN) de las células, causar mutaciones, roturas cromosómicas y alteraciones en la replicación celular (Shibahara et al., 1995; IARC, 2002).
Dado que la leche y sus derivados son alimentos de consumo amplio y habitual, especialmente en poblaciones vulnerables como niños, embarazadas y personas mayores, la presencia de AFM1 supone un importante riesgo para la salud pública. Por este motivo, la regulación y el control analítico de esta micotoxina son esenciales en la cadena alimentaria.
Origen y factores de contaminación
Producción fúngica y condiciones predisponentes
La contaminación fúngica de las materias primas puede producirse tanto en el campo como durante el almacenamiento. Los factores que favorecen el crecimiento de Aspergillus spp. y la síntesis de aflatoxinas incluyen:
- Temperatura: entre 25 y 35 °C es óptima para el crecimiento fúngico.
- Humedad relativa: superior al 70-85 % o contenido de humedad del grano superior al 13-14 %.
- Estrés hídrico: sequías seguidas de lluvias favorecen la infección del cultivo en campo.
- Daños físicos: insectos, roedores o golpes facilitan la entrada del hongo en el grano.
- Cambio climático: el aumento de temperaturas medias y episodios de sequía incrementa la prevalencia de aflatoxinas en zonas templadas, incluyendo Europa (Battacone et al., 2009; Chhaya et al., 2023).
Estabilidad de la AFM1 en productos lácteos
Una característica relevante de la AFM1 es su notable estabilidad térmica. Los procesos tecnológicos habituales aplicados a la leche, pasteurización (72 °C/15 s), UHT (135-140 °C/2-5 s) y esterilización, reducen la concentración de AFM1 solo entre un 10 % y un 20 %, insuficiente para eliminarla por completo. Asimismo, la AFM1 es ligeramente más soluble en la fase acuosa que en la grasa, por lo que la desnatación de la leche no resulta un método eficaz de reducción. En la fabricación de quesos, hasta el 40-50 % de la AFM1 puede concentrarse en la cuajada, lo que supone un riesgo adicional en los derivados lácteos sólidos (Battacone et al., 2009; Becker-Algeri et al., 2016).
Marco regulatorio
Debido al riesgo que supone la AFM1 para la salud humana, las autoridades sanitarias han establecido límites máximos de contaminación en leche y derivados:
| Organismo | Producto | Límite máximo (µg/kg) |
| Unión Europea (Reg. (CE) 1881/2006) | Leche cruda, tratada térmicamente y para fabricación de productos lácteos | 0,050 |
| Unión Europea | Alimentos elaborados para lactantes y niños de corta edad | 0,025 |
| Codex Alimentarius (FAO/OMS) | Leche | 0,500 |
| EE. UU. (FDA) | Leche | 0,500 |
| China | Leche y productos lácteos | 0,500 |
Tabla 1. Límites máximos de AFM1 en leche según diferentes organismos reguladores.
La Unión Europea aplica uno de los límites más estrictos a nivel mundial (0,050 µg/kg). La EFSA realiza evaluaciones periódicas de la exposición dietética de la población a la AFM1, especialmente en grupos vulnerables, y puede revisar dichos límites en función de nueva evidencia científica (EFSA, 2020).
La leche como matriz analítica
Complejidad de la matriz
La leche es reconocida en química analítica como una matriz compleja, dado que contiene una gran variedad de componentes que pueden interferir con la detección del analito de interés. Sus componentes principales son:
- Grasa: debe eliminarse antes del análisis, generalmente mediante centrifugación y filtración, ya que interfiere en la extracción y puede obstruir los sistemas cromatográficos.
- Proteínas: especialmente la caseína y las proteínas del suero, que pueden coprecipitar con el analito o generar señales interferentes. Se eliminan mediante precipitación (calor, acetonitrilo o ácidos) o mediante filtración en membranas de tamaño de exclusión.
- Lactosa: puede interferir en técnicas altamente sensibles como la HPLC-MS/MS debido al efecto matriz (supresión o aumento de la ionización del analito).
- Sales minerales y vitaminas: en concentraciones menores, con interferencias generalmente despreciables en el análisis de micotoxinas (Universidad de Murcia, s.f.).
Ventajas frente a otras matrices
A pesar de su complejidad, la leche presenta ciertas ventajas analíticas respecto a matrices sólidas como cereales o piensos. Al ser una matriz líquida homogénea, la transferencia del analito durante la extracción es más eficiente y reproducible. Asimismo, la representatividad de la muestra es mayor, al ser más fácil obtener alícuotas representativas del lote. Además, los procesos de limpieza del extracto suelen ser menos laboriosos que en muestras sólidas.
Pretratamiento de la muestra
El pretratamiento estándar de la leche para el análisis de AFM1 incluye la desnatación por centrifugación (3000-5000 rpm, 10 min), seguida de la dilución o extracción del analito con solventes orgánicos (metanol, acetonitrilo) o mediante columnas de inmunoafinidad (IAC). Las columnas IAC presentan alta selectividad y son el método de referencia recomendado por la normativa europea para la purificación del extracto previo a la determinación cromatográfica (Anfossi et al., 2013; Reglamento (CE) 401/2006).
Técnicas analíticas para la detección de AFM1
Existen diversas técnicas analíticas validadas para la detección y cuantificación de AFM1 en leche. Las más empleadas a nivel comercial y en laboratorio son el flujo lateral, el ELISA y el HPLC-MS/MS. A estas se suman otras técnicas emergentes como los biosensores, la espectroscopía de fluorescencia y la PCR aplicada a la detección del hongo productor.
Inmunocromatografía en flujo lateral (Lateral Flow Assay, LFA)
El análisis por flujo lateral se basa en la técnica de inmunocromatografía (ICA) y se caracteriza por ser un análisis rápido, de bajo coste y muy útil para análisis de campo. El tratamiento de la muestra previo es mínimo y la prueba no requiere formación técnica especializada, lo que facilita su aplicación en entornos con recursos limitados (Anfossi et al., 2013).
Puede emplearse de forma cualitativa (presencia/ausencia del analito) o cuantitativa (concentración del analito), mediante lectores portátiles que digitalizan la señal de las tiras reactivas. El principio de funcionamiento se basa en una reacción competitiva: el analito libre de la muestra compite con el analito conjugado a nanopartículas de oro (u otros marcadores) por los anticuerpos inmovilizados en la membrana.
Ventajas: rapidez (resultado en ≤ 10 min), bajo coste, portabilidad, facilidad de uso.
Limitaciones: menor sensibilidad que ELISA e HPLC-MS/MS, posibles falsos positivos por reacción cruzada con otras aflatoxinas, menor precisión cuantitativa.
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
La técnica ELISA es un inmunoensayo enzimático que cuantifica el analito a partir de la unión específica antígeno-anticuerpo, generando una señal colorimétrica medida mediante espectrofotometría de microplaca. Existen dos formatos principales para AFM1: ELISA directo (el analito se une al anticuerpo inmovilizado en la placa) y ELISA competitivo (el analito de la muestra compite con el analito conjugado a enzima).
Existen kits comerciales validados específicamente para la detección de AFM1 en leche, con un límite de detección de aproximadamente 2 ppt y un límite de cuantificación de aproximadamente 5 ppt. El tiempo de análisis oscila entre 60 y 90 minutos. Requiere un espectrofotómetro de microplaca y cierta formación técnica para la interpretación de resultados.
Ventajas: alta sensibilidad, procesado de múltiples muestras en paralelo, kits estandarizados.
Limitaciones: mayor coste que el flujo lateral, posible efecto de matriz, necesidad de equipamiento específico.
HPLC-MS/MS (Cromatografía Líquida de Alta Resolución acoplada a Espectrometría de Masas en Tándem)
La HPLC-MS/MS es la técnica de referencia para la detección y cuantificación de AFM1 en leche, y la recomendada por los organismos reguladores europeos para la confirmación de resultados positivos. Combina la capacidad de separación cromatográfica (que permite distinguir la AFM1 de otras micotoxinas y compuestos de la matriz) con la detección por espectrometría de masas en tándem, que proporciona alta especificidad mediante la selección de transiciones de ion precursor a ion producto características de la AFM1.
Su límite de detección puede ser inferior a 0,01 µg/kg (< 10 ppt), ampliamente por debajo del LMC europeo de 0,050 µg/kg. Una ventaja adicional es la posibilidad de detectar múltiples micotoxinas simultáneamente en un mismo análisis, lo que incrementa la eficiencia del control analítico.
Ventajas: máxima sensibilidad y especificidad, capacidad multi-analito, método confirmatorio oficial.
Limitaciones: coste elevado (equipo y mantenimiento), necesidad de personal altamente cualificado, tiempo de análisis prolongado (> 90 min), efecto de matriz que requiere calibración con patrón interno isotópico.
| Técnica analítica | Coste | Dificultad | Tiempo (min) | Límites de detección (ppt) | Multi-analito |
| Flujo lateral | € | + | ≥ 10 | 6 | No |
| ELISA | €€ | ++ | > 60-90 | 2 | No |
| HPLC-MS/MS | €€€ | +++ | > 90 | < 1 | Sí |
Tabla 2. Comparativa de técnicas analíticas para la detección de AFM1 en leche. Adaptada de Universidad de Jaén (2017).
Análisis de AFM1 como estrategia de mitigación de micotoxinas
El análisis de AFM1 en leche o derivados permite estimar indirectamente la cantidad de AFB1 ingerida por el animal a través de las materias primas o piensos contaminados. Dado que entre el 1 % y el 6 % de la AFB1 total se metaboliza a AFM1 (Gimeno, 2004; Battacone et al., 2009), es posible inferir los niveles de contaminación del pienso a partir de los resultados del análisis de la leche.
Esta estrategia de back-calculation (cálculo retrospectivo) es especialmente útil cuando no se dispone de análisis previos de las materias primas, y permite justificar la necesidad de intervenciones correctoras en la alimentación del animal.
Conclusiones
La aflatoxina M1 representa un contaminante de elevada relevancia en la cadena láctea. Aunque menos carcinogénica que la AFB1, su alta genotoxicidad, su estabilidad frente a los tratamientos tecnológicos y la amplia exposición poblacional justifican su rigurosa regulación y control analítico.
Por este motivo, el análisis del biomarcador AFM1 en leche se posiciona como una herramienta fundamental para garantizar la seguridad alimentaria de los consumidores. En este escenario, resulta fundamental conocer las diferentes técnicas analíticas disponibles en el mercado, con el fin de seleccionar la opción más adecuada dependiendo del contexto y del propósito del análisis.
Dada la elevada toxicidad de la aflatoxina B1 (AFB1) como contaminante alimentario, la implementación de estrategias de mitigación es necesaria, orientada a disminuir su biodisponibilidad sistémica, atenuando así los efectos tóxicos tanto de la molécula precursora como de su metabolito hidroxilado, la aflatoxina M1 (AFM1).
